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  • 从JAK1/STAT3信号通路探讨复方胃炎合剂抑制慢性萎缩性胃炎进展的分子机制

    发布时间:2021-06-25 来源:未知

      
          摘    要:
    目的探讨复方胃炎合剂对慢性萎缩性胃炎(CAG)模型大鼠JAK1/STAT3信号通路及炎性因子释放水平的影响。方法随机将SPF级Wistar大鼠分为空白组、空白+中药组、模型组、维酶素组及复方胃炎合剂低、中、高剂量组,采用“饥饱失常+潮湿环境+高脂高糖饮食”造模方法构建病证结合CAG大鼠模型,采用HE染色观察大鼠胃黏膜病变情况,并运用Real-timePCR、ELISA法检测胃组织中JAK1、STAT3mRNA及血清中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的表达量。结果HE染色提示,与空白组比较,模型组大鼠胃黏膜萎缩、减少,可见肠上皮化生及上皮内瘤变。大鼠胃黏膜组织JAK1、STAT3表达水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,中药各治疗组胃黏膜固有腺体萎缩及炎症程度均有明显改善,组织中JAK1、STAT3mRNA与促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8表达水平均有所下降,抗炎因子IL-10表达水平均有所上升(P<0.05或P<0.01)。结论复方胃炎合剂可能通过抑制JAK1/STAT3信号通路,调控炎性细胞TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的转录及释放,从而抑制CAG的进展。
      
      关键词:复方冒炎合制:慢性萎缩性胃炎JAKI STAT3.大鼠
      
      Discussion on the Molecular Mechanism of Compound Gastritis Mixture Inhibiting the
      
      Progress of Chronic Atrophic Gastritis from JAK1/STAT3 Signaling Pathway
      
      TIAN Lin HUANG Minghan LI Sihan LIN Ping ZHENG Rong
      
      SHI Jingyao
      
      The Second People's Hospital Afliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine
      
      Dominant Subject of Spleen-Stomach Characteristics Fujan University of Traditional Chinese
      
      Medicine School of Basic Medicine, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
      
      People's Hospital Afliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine
      
      Abstract:Objective To study the effect of Compound Gastritis Mixture on JAK1/STAT3 signaling pathway and inflammatory factor release level in rats with chronic atrophic gastritis. Methods clean-grade Wistar rats were randomly divided into blank group, blank+Chinese medicine group, model group, vitacoenzyme tablet group and low, medium and high dose group of Compound Gastritis Mixture. The CAG rats with spleen deficiency and damp heat syndrome was established by using the method of "hunger and satiety disorder+wet environment+high fat and high sugar diet". HE staining was used to observe the gastric mucosal lesions of rats, and Real-time PCR and ELISA were used to detect gastric tissues. Results HE staining showed that compared with the blank group, the gastric mucosa of the model group was atrophied and decreased, intestinal metaplasia and intraepithelial neoplasia were visible, and the expression levels of JAK1 and STAT3 in gastric mucosa of rats were significantly increased (P<0.01). Compared with the model group, the atrophy and inflammation degree of the inherent glands of gastric mucosa in each treatment group were significantly improved, and the expressions of JAK1, STAT3, TNF-α, IL-6 and IL-8 decreased, while the expressions of IL-10 increased (P<0.05 or P<0.01). Conclusion Compound Gastritis Mixture may regulate the transcription and release of TNF-α, IL-6, IL-8 and IL-10 in inflammatory cells by inhibiting JAK1/STAT3 signaling pathway, thus inhibiting the progress of CAG.
      
      Keyword:compound gastritis mixture; chronic atrophic gastritis; JAK1; STAT3; rat;
      
      慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)指胃黏膜组织固有腺体萎缩、减少,胃黏膜层变薄,伴或不伴有肠上皮化生、不典型增生的一种慢性消化系统疾病[1],CAG、胃癌前病变(Precancerous lesions of gastric cancer,PLGC)及胃癌三者的关系十分密切。在我国,胃癌是发生率最高的消化道恶性肿瘤,近年来胃癌发病率与病死率虽有所下降,但由于人口老龄化加剧等因素,胃癌仍极大的影响着我国公共卫生安全[2],因此,对CAG有效的治疗手段的需求显得更为迫切。复方胃炎合剂是在国医大师杨春波教授创制的“胃炎1号”、“胃炎合剂”[3,4]基础上,结合中医证素研究[5]优化而成,临床疗效显著[6]。研究发现[7],Janus激酶(janus kinases,JAKs)-信号转导子与转录激活子(signal transducers and activators of transcription,STATs)信号转导通路广泛参与了组织细胞的增殖、凋亡及分化,是机体中众多细胞因子共同的传导路径,其中JAK1/STAT3信号通路的活化与CAG的发生、进展关系密切。基于此,本文从JAK1/STAT3信号通路为出发点,探讨复方胃炎合剂治疗CAG的作用机制,以期为复方胃炎合剂的临床应用提供进一步依据。
      
      1 实验材料
      
      1.1 实验动物
      
      健康Wistar大鼠59只,雄性,体重(200±20)g,6周龄,SPF级,由上海斯莱克实验动物有限公司提供。
      
      1.2 实验药物
      
      复方胃炎合剂(炙黄芪15 g,党参10 g,麸炒白术10 g,枳壳6 g,茯苓15 g,法半夏10 g,白芍10 g,砂仁4.5 g,佩兰10 g,黄连3 g,陈皮6 g,地龙干15 g,莪术6 g,甘草3 g),由福建中医药大学附属第二人民医院药剂室提供。将10剂上述药物浸泡于8倍量水中0.5 h后煎煮3次,时间分别为1.5 h、1.0 h、0.5 h,合并煎液并过滤,并减压浓缩至500 mL,每毫升含生药2.47 g,灭菌分装,冷藏至4℃备用。维酶素片,由北海阳光药业有限公司生产,规格0.2 g/片,批号:190105;盐酸雷尼替丁胶囊,赛诺菲杭州制药有限公司生产,规格0.15 g/粒,批号:4061。
      
      1.3 实验试剂
      
      1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍,百灵威科技有限公司,货号:OR301388;TRNzol总RNA提取试剂,天根生化科技北京有限公司,货号:DP424;PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser,TaKaRa,货号:RR047B;SYBR® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus), ROX plus,TaKaRa,货号:RR82LR;DL2,000 DNA Marker,TaKaRa,货号:3427Q。大鼠IL-6酶联免疫试剂盒,Solarbio,货号:SEKR-0005;大鼠白介素-10酶联免疫试剂盒,博士德生物工程有限公司,货号:EK0418;大鼠白介素-8酶联免疫试剂盒,Solarbio,货号:SEKR-0071;大鼠TNF-α酶联免疫试剂盒,博士德生物工程有限公司,货号:EK0526。引物由美国Invitrogen公司合成,引物序列见表1。
      
      表1 PCR引物序列
      
      2 实验方法
      
      2.1 模型构建
      
      从59只大鼠中随机抽取16只作为正常饲养组,余43只则为CAG造模组。造模方法:①饮用水在蒸馏水基础上添加1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍,浓度120μg/mL,自由饮用;②雷尼替丁每日灌胃1次,剂量为0.03g/(kg·d);③空腹予45%乙醇灌胃,每次2mL,每周2次;④每周末禁食一天。连续造模24周后,随机抽取3只大鼠处死,取胃组织标本行病理学检查,验证模型是否成功。
      
      CAG造模成功后,进行病证结合CAG模型构建:单日禁食,自由饮蒸馏水,双日高脂高糖饮食,饮用20%蜂蜜水;每间隔一日早上灌服油脂一次,剂量为l0g/(kg·d),下午灌服56度白酒一次,剂量为10mL/kg。上述干预2周后,放入人工气候箱5天,维持相对湿度95%,相对温度30~34℃。经以上干预,CAG造模组大鼠出现扎堆现象,被毛蓬松无光泽,毛色偏黄,尾色瘀青,舌质稍紫,唇周色暗,小便量多色黄,大便便溏或黏稠发暗,馊臭明显,造成脾虚痰湿热瘀证CAG大鼠模型。
      
      2.2 分组及给药
      
      病证结合CAG成功造模后,将造模组大鼠随机分为CAG模型组、维酶素组及中药低、中、高剂量组。将正常饲养组大鼠随机分为空白组和空白+中药组,共7组,每组各8只。中药低、中、高剂量组分别按照2.5mL/(kg·d)、5mL/(kg·d)、10mL/(kg·d)的中药原液剂量,空白+中药组的剂量参照高剂量组,并根据体重,用生理盐水稀释至每次5mL灌胃;维酶素组大鼠予以0.2g/kg配比维酶素悬浊液,稀释至每次5mL灌胃;空白组、模型组大鼠给予每次5mL/只生理盐水灌胃。均连续干预30天。
      
      2.3 标本采集
      
      干预结束后,各组大鼠禁食12小时后,予乙醚玻璃罩麻醉法。麻醉成功后剖开腹腔,腹主动脉取血,每只5mL,取血结束后处死并取胃组织。取适量胃窦组织用4%多聚甲醛固定。剩余大鼠胃黏膜组织立即放入液氮中保存备用。所取血立即离心,分装上层血清于-80 ℃条件下保存备用。
      
      2.4 胃黏膜组织病理观察
      
      按5 μm厚度切片,常规HE染色,显微镜下观察各组大鼠胃黏膜组织的病理学改变。
      
      2.5 Real-time qPCR检测
      
      Real-time qPCR检测组织中JAK1、STAT3 mRNA的表达水平。将各组大鼠胃黏膜组织研磨后,提取、纯化总RNA,使用紫外分光光度计进行RNA浓度和纯度测定,再采用日本TaKaRa公司PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser产品进行cDNA反转录,实验操作严格按产品说明书进行,PCR反应条件见表2。
      
      表 2 RT-qPCR检测参数
      
      2.6 ELISA法
      
      ELSIA法检测大鼠血清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8及抗炎性细胞因子IL-10的含量,操作方法按照试剂盒进行。
      
      2.7 统计学分析
      
      数据运用SPSS 20.0统计软件进行数据分析,计量资料用“”表示。若数据符合正态分布及方差齐性,则采用单因素方差分析方法,并采用LSD检验进行组间两两比较;否则采用Kruskal-Wallis H检验进行分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。
      
      3 结果
      
      3.1 各组大鼠胃黏膜组织病理变化比较
      
      空白组、空白+中药组大鼠胃黏膜上皮细胞排列紧密整齐,细胞形态规则,未见腺体萎缩、减少,未见肠上皮化生及异型细胞;与空白组比较,模型组大鼠胃黏膜可见腺体萎缩、减少,腺体排列紊乱、形态多变,伴大量炎症细胞浸润,可见肠上皮化生和偶见上皮内瘤变;与模型组比较,维酶素组及中药各组组织病理学均可见不同程度改善,其中以中药中、高剂量组改善最为明显。维酶素组和中药低剂量组细胞形态、排列仍欠规则,可见少量散在炎症细胞。中药中、高剂量组细胞排列较为整齐,细胞核形状、大小较均匀,未见明显炎症细胞浸润。见图1。
      
      3.2 各组大鼠胃组织JAK1、STAT3 mRNA表达比较
      
      与空白组比较,模型组JAK1、STAT3 mRNA表达量显著上升,差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,空白+中药组及中药各剂量组JAK1、STAT3 mRNA表达量均降低,其中以中药高剂量组降低最为明显(P<0.01)。与维酶素组比较,中药各治疗组JAK1、STAT3 mRNA表达量均有明显降低,除中药低剂量组JAK1 mRNA外,差异均有统计学意义(P<0.01),见表3。
      
      表3 各组大鼠胃组织JAK1、STAT3 mRNA表达水平比较
      
      3.3 各组大鼠胃组织TNF-α、IL-6、IL-8及IL-10表达比较
      
      与空白组相比,CAG模型组TNF-α、IL-6、IL-8表达水平均明显增高,IL-10表达水平均明显降低(P<0.01)。与模型组相比,中药高、中、低剂量组TNF-α、IL-6、IL-8表达水平显著降低,以高剂量组表现明显,IL-10表达水平均明显升高(P<0.01)。与维酶素组比较,中药低剂量组TNF-α、IL-6、IL-8表达水平增高(P<0.05或P<0.01),中药低剂量组IL-10表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);中药中剂量组TNF-α表达水平增高(P<0.01),但IL-6、IL-8及IL-10表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);中药高剂量组TNF-α、IL-6表达水平降低(P<0.05或P<0.01),IL-10表达水平升高(P<0.01),但IL-8表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表4。
      
      表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10水平比较
      
      4 讨论
      
      现代医学认为,CAG的发病与不良饮食习惯、胆汁反流、幽门螺杆菌感染、免疫因素等关系密切,并由炎症、细胞凋亡以及基因表达异常等多种机制调控[8,9]。CAG属中医“痞满”“胃痞”“胃痛”等疾病范畴,近年来,中医对CAG的病因病机的论述日益深入。李佃贵[10]认为浊毒内蕴为CAG的基本病机,“浊毒”贯穿疾病发病的始终,主张以“降浊解毒”为治疗大法,并善用虫类药物治疗CAG伴肠上皮化生或异性增生;徐景藩[11]认为脾胃乃气机升降之枢纽,易致“瘀”,脾胃常见的病理因素如气滞、气虚、阴虚、出血等皆易致瘀,故强调“瘀”在CAG发生发展过程中的重要性;张杰[12]则将CAG发病概括为“虚、毒、瘀”互结,认为脾虚为本、内外毒邪为因、血瘀贯穿始终,创立“肝脾建中、脾阳为本”理论,主张肝脾同建、顾护脾阳,从而阻断和逆转CAG发病进程。结合福建地域特点,我们认为CAG以脾胃气虚为本,常见“湿、热、痰、瘀、气滞”等标证,其根本病机为脾胃气虚,脾胃运化功能失调,津液停聚,聚湿成痰,痰、湿阻滞于胃,日久痰湿化热、久踞成瘀,从而使胃气瘀郁滞、胃络瘀阻,湿、热、痰、瘀交阻,损伤胃络,致胃黏膜腺体萎缩、肠上皮化生或异型增生[13]。基于此病机,复方胃炎合剂通过健脾益气,兼以化湿、祛痰、理气、舒络,有效减缓或逆转CAG的发生、发展。
      
      JAKs是细胞内一类非受体型蛋白酪氨酸激酶,通过与受体的BOX1和BOX2框偶联,介导一系列磷酸化反应,在多种细胞因子的信号传导中起着重要作用。其由四个家族成员JAK1、JAK2、JAK3及TYK2组成。细胞因子与细胞相关受体结合后,使JAKs聚合,发生磷酸化,从而激活传导通路的下游信号,参与体内多种疾病的发生发展。JAK1作为JAKs家族成员之一,参与了各种细胞因子、干扰素的信号传导,在炎症与肿瘤的发生发展中发挥了重要作用[14,15]。JAKs通过磷酸化STAT来响应细胞因子或生长因子的刺激。活化的JAKs通过极为保守的SH2结构域与STATs蛋白结合,使STATs磷酸化,激活的STAT被运送到细胞核中并不断积累,结合DNA,调节基因表达[16]。STATs为信号转导与转录激活子,目前发现STAT有7个家族成员,即STAT 1至6,STAT5又分为STAT5a、STAT5b。其中STAT3是多条信号通路的交汇点,在多种恶性肿瘤的组织及细胞中都有过度表达,如:多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤等,其激活与肿瘤的发生密切相关,调控肿瘤的形成、侵袭、转移、免疫逃避和耐药性[17]。Zhang等[18]研究表明,肠上皮化生患者胃黏膜组织中STAT3表达阳性率为23.1%,在处于早期、进展期及伴有淋巴结转移的胃癌中,STAT3表达阳性率均有较高表达,分别为66.7%、71.1%、63.9%。JAK1/STAT3信号通路的激活促进巨噬细胞发生极化,M1型分化巨噬细胞主要释放促炎因子如:TNF-α、IL-6、IL-8;M2型巨噬细胞则释放抗炎因子如:IL-4、IL-10。JAK1/STAT3信号通路的活化维持着炎症细胞及炎性因子的高表达,炎症因子进一步刺激着JAK1/STAT3信号通路的激活,炎症持续刺激不断加剧CAG的病理改变。因此,抑制JAK1/STAT3信号通路,是治疗CAG的重要思路。
      
      在本研究中,采用了病证结合的造模方法构建脾虚痰湿热瘀证CAG大鼠模型。研究结果证明,复方胃炎合剂各剂量组大鼠的胃黏膜病理均较模型组改善,以中药中、高剂量组改善最为明显,由此可知该方对于CAG的疗效确切。对JAK1/STAT3通路的研究表明,CAG模型组大鼠胃黏膜细胞JAK1/STAT3信号通路处于激活状态,经复方胃炎合剂干预后,JAK1、STAT3 mRNA表达水平显著下调,表明复方胃炎合剂可通过抑制JAK1/STAT3信号通路,改善CAG大鼠的胃黏膜病理改变,抑制CAG进展。
      
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