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  • 大蒜素联合顺铂对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用

    发布时间:2021-04-12 来源:未知

      摘    要:
      
      目的 探讨大蒜素联合顺铂对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用并探讨其机制。方法 取对数生长期HeLa细胞,设对照组、大蒜素(50μg/mL)组、顺铂(5μg/mL)组、联合给药组(大蒜素50μg/mL+顺铂5μg/mL)。药物干预48 h后,通过MTT法检测细胞增殖抑制率,运用CompuSyn软件计算大蒜素与顺铂联合指数(CI),流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡水平,Western blotting法检测Cyclin D1、CDK2、P27、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 与大蒜素组和顺铂组比较,联合给药组HeLa细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05、0.01),CI为0.69(提示大蒜素与顺铂具有中度协同效应)。与对照组比较,大蒜素组和顺铂组G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率显著升高(P<0.05、0.01),Cyclin D1、CDK2、Bcl-2表达显著下调且P27、Cleaved Caspase-3、Bax表达显著上调(P<0.05、0.01),Bax/Bcl-2比值显著升高(P<0.01)。与大蒜素组和顺铂组比较,联合给药组G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率显著升高(P<0.05、0.01),Cyclin D1表达显著下调且P27、Cleaved Caspase-3、Bax表达显著上调(P<0.05、0.01),Bax/Bcl-2值显著升高(P<0.01)。结论 大蒜素联合顺铂具有协同抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖的作用,可能与调节细胞周期和凋亡相关蛋白表达,进而阻滞细胞周期进程并促进细胞凋亡有关。
      
      关键词:
      
      大蒜素 顺铂 宫颈癌 细胞增殖 协同作用
      
      Inhibitory effect of allicin combined with cisplatin on proliferation of human cervical cancer cells
      
      LI Aili ZHAO Fei LI Aijing ZHANG Tongyan YU Hui
      
      Department of Gynecology, Handan Central Hospital; Department of General Surgery, Handan Central Hospital; Renqiu People's Hospital;
      
      Abstract:
      
      Objective To investigate the inhibitory effect of allicin combined with cisplatin on the proliferation of human cervical cancer HeLa cells and explore its mechanism. Methods HeLa cells in logarithmic growth phase were set control group(culture solution only), allicin group(50 μg/mL), cisplatin group(5 μg/mL) and combination group(50 μg/mL allicin + 5 μg/mL cisplatin).48 h after given drugs, the proliferation inhibition rate of HeLa cells was detected by MTT method, the allicin and cisplatin combination index(CI) was calculated by CompuSyn software; the cell cycle distribution and apoptosis level were detected by Flow Cytometry; the expression of Cyclin D1, CDK2, P27, Cleaved Caspase-3, Bcl-2, Bax proteins were detected by Western blotting.Results Compared with allicin group and cisplatin group, the proliferation inhibition rate of combination group was significantly increased(P < 0.05 or 0.01), CI was 0.69(which suggested that allicin and cisplatin have moderate synergistic effect). Compared with control group, the cell ratio in G0/G1 phase and the apoptosis rate in allicin group and cisplatin group were significantly increased(P < 0.05 or 0.01), the expressions of Cyclin D1, CDK2, Bcl-2 were significantly decreased and P27, Cleaved Caspase-3,Bax were significantly increased(P < 0.05 or 0.01), the ratio of Bax/Bcl-2 was significantly increased(P < 0.01). Compared with allicin group and cisplatin group, the cell ratio in G0/G1 phase and the apoptosis rate in combination group were significantly increased(P < 0.05 or 0.01), the expressions of Cyclin D1 was significantly decreased and P27, Cleaved Caspase-3, Bax were significantly increased(P < 0.05 or 0.01), the ratio of Bax/Bcl-2 was significantly increased(P < 0.01). Conclusions Allicin combined with cisplatin has the synergistically effects on inhibiting the proliferation of human cervical cancer HeLa cells; which may be related to the regulation of cell cycle and apoptosis-related protein expression, thereby blocking cell cycle progress and promoting cell apoptosis.
      
      Keyword:
      
      allicin; cisplatin; cervical cancer; cell proliferation; synergy;
      
      宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率和致死率居女性恶性肿瘤第4位[1]。随着临床诊断与治疗技术的进步,宫颈癌早期诊断率和生存期明显提高和延长,但ⅡB期患者5年生存率不足60%,Ⅲ、Ⅳ期患者5年生存率不足30%[2]。目前,以顺铂为主的铂类药物化疗仍是临床上治疗晚期宫颈癌的首选方案,但获得性耐药所致化疗敏感性降低是严重影响化疗效果、导致癌症复发转移的主要因素之一[3]。因此,研究能够提高化疗敏感性、协同化疗抑制癌细胞生长的新型药物或许是延长宫颈癌患者生存期的有效手段。大蒜素是天然存在于大蒜鳞茎中的一种二烯丙基三硫化物,具有良好的抗妇科肿瘤活性[4],能够通过阻滞细胞周期进程、促进细胞凋亡而提高人子宫内膜癌细胞顺铂化疗敏感性[5]。本研究将以人宫颈癌He La细胞为受试细胞,研究大蒜素与顺铂对人宫颈癌细胞增殖的协同抑制作用并探索其机制。
      
      1 材料
      
      1.1 细胞、药物与主要试剂
      
      人宫颈癌He La细胞系,购自中国科学院上海生化细胞所细胞库。大蒜素注射液(规格5 m L∶60 mg)购自上海禾丰制药有限公司(批号4E38002);顺铂注射液(规格6 m L∶30 mg)购自江苏豪森药业股份有限公司(批号1911004);DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶购自美国Hyclone公司;胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;MTT购自美国Sigma公司;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)试剂盒购自美国BD公司;细胞周期素D1(Cyclin D1)抗体、周期蛋白依赖激酶2(CDK2)抗体、P27抗体、激活型半胱胺酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗体、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体,购自北京索莱宝生物科技有限公司;BCA蛋白浓度检测试剂盒、ECL超敏发光试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。
      
      1.2 主要仪器
      
      Heal Force HF90型细胞培养箱(上海力申科学仪器有限公司);Cedex XS型细胞计数仪(瑞士Roche公司);FACSria型流式细胞仪(美国BD公司);LB940型多功能酶标仪(德国Berthold公司);VE-180型垂直电泳槽、VE-186型转膜仪(上海天能科技有限公司);EC3 410型化学发光成像系统(美国UVPN公司)。
      
      2 方法
      
      2.1 细胞培养、分组与给药干预
      
      人宫颈癌He La细胞经解冻复苏后培养于含10%FBS、100 U/m L青链霉素双抗的DMEM培养基,置37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养,每3天换培养液1次,传代4次后取对数生长期He La细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后制备浓度1×105/m L的单细胞悬液,每孔100μL接种于96孔板和每孔1 m L接种于6孔板,96孔板和6孔板分别设对照组、大蒜素(50μg/m L[6]大蒜素注射液)组、顺铂(5μg/m L[7]顺铂注射液)组、联合给药(大蒜素注射液50μg/m L+顺铂注射液5μg/m L)组;继续培养24 h后,各组更换含药培养基(对照组更换常规无药培养基),继续培养48 h后行各指标检测。
      
      2.2 细胞增殖抑制率检测及联合指数(Combination Index,CI)的计算
      
      各组分别取10个复孔(96孔板)经药物干预48 h的He La细胞,10μL/孔滴加MTT溶液(质量浓度5 mg/m L),继续培养4 h,150μL/孔加入DMSO后37℃、避光震荡10 min后,通过酶标仪测定490 nm处吸光度(A)值,计算细胞增殖抑制率。运用Compu Syn软件计算大蒜素与顺铂CI,根据CI值判断两药联合效果[9]:<0.6为强协同作用,0.6~0.8为中度协同作用,0.8~0.9为弱协同作用,0.9~1.1为相加作用,≥1.1为拮抗作用。
      
      2.3 细胞周期分布检测
      
      各组分别取10个复孔(96孔板)经药物干预48 h的He La细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后2 000 r/min离心5 min收集细胞,PBS洗涤2次后-20℃、75%乙醇固定1 h,PBS洗涤2次后加入5μL水解酶,37℃放置1 h后加入PI染液,避光孵育30 min,然后通过流式细胞仪检测各组细胞周期分布。
      
      2.4 细胞凋亡的检测
      
      各组分别取10个复孔(96孔板)经药物干预48 h的He La细胞,经0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化后离心收集细胞,PBS洗涤2次后重悬细胞,避光5μL/孔加入Annexin V-FITC轻轻混匀后孵育15 min,5μL/孔加入PI染液,轻轻混匀后孵育5 min,通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡水平。
      
      2.5 蛋白表达检测
      
      各组分别取10个复孔(6孔板)经药物干预48 h的He La细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后离心收集细胞,超声破碎处理后,4℃、12 000 r/min离心20 min取上清,BCA法检测蛋白含量,95℃水浴5 min使蛋白变性后,采用Western blotting法检测蛋白表达:30μg蛋白量上样、SDS-PAGE胶电泳、转膜、5%蛋白免疫印迹封闭液室温封闭2 h,滴加目标蛋白、β-actin抗体4℃孵育12 h,PBS洗膜2次后滴加二抗37℃孵育1 h,滴加ECL化学发光后通过化学发光成像系统显示蛋白条带,以β-actin为内参、通过条带灰度值半定量目标蛋白表达量。
      
      2.6 统计学分析
      
      运用Graph Pad prism 6进行统计分析,计量资料以表示,多组间比较行单因素方差分析,两两比较行t检验。
      
      3 结果
      
      3.1 各组He La细胞增殖抑制率测定结果
      
      与对照组比较,大蒜素组、顺铂组、联合给药组He La细胞增殖抑制率显著升高(P<0.01);与大蒜素组和顺铂组比较,联合给药组He La细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05、0.01)。见图1。
      
      图1 各组人宫颈癌He La细胞增殖抑制率
      
      3.2 大蒜素与顺铂CI计算结果
      
      通过Compu Syn软件计算,大蒜素与顺铂的CI值为0.69,说明大蒜素联合顺铂对He La细胞增殖具有中度协同抑制作用。
      
      3.3 各组He La细胞凋亡水平检测
      
      对照组可见少量凋亡细胞;与对照组比较,大蒜素组、顺铂组、联合给药组细胞凋亡率显著升高(P<0.01);与大蒜素组和顺铂组比较,联合给药组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。见图2。
      
      3.4 各组He La细胞周期分布检测结果
      
      与对照组比较,大蒜素组、顺铂组、联合给药组He La细胞处于G0/G1期的比例显著升高、G2/M期细胞比例显著降低(P<0.01);与大蒜素组和顺铂组比较,联合给药组G0/G1期细胞比例显著升高,且G2/M期细胞比例显著降低(P<0.05、0.01)。见图3。
      
      图2 各组人宫颈癌He La细胞凋亡水平
      
      3.5 各组Cyclin D1、CDK2、P27蛋白表达检测
      
      与对照组比较,大蒜素组、顺铂组、联合组He La细胞Cyclin D1、CDK2表达显著下调而P27表达显著上调(P<0.05、0.01);与大蒜素组和顺铂组比较,联合组Cyclin D1表达显著下调而P27表达显著上调(P<0.01)。见图4。
      
      3.6 各组He La细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达检测结果
      
      与对照组比较,大蒜素组、顺铂组、联合给药组He La细胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著上调,而Bcl-2蛋白表达显著下调(P<0.05、0.01),Bax/Bcl-2值显著升高(P<0.01);与大蒜素组和顺铂组比较,联合给药组Cleaved Caspase-3、Bax表达显著上调(P<0.01),Bax/Bcl-2值显著升高(P<0.01)。见图5。
      
      4 讨论
      
      目前,手术结合术后化疗是宫颈癌的主要治疗方案,顺铂是最为常用的化疗药物之一,特别是转移性宫颈癌,但广泛的毒副作用和获得性耐药严重制约了其临床应用[9]。联合用药是降低化疗毒副作用和改善肿瘤细胞化疗敏感性的常用方法,中药以副作用小、耐药率低的特点成为联合化疗药物抗肿瘤的研究热点[10-11]。
      
      图3 各组人宫颈癌He La细胞周期分布
      
      图4 各组人宫颈癌He La细胞Cyclin D1、CDK2、P27蛋白表达
      
      图5 各组人宫颈癌He La细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达
      
      大蒜素是天然存在于大蒜鳞茎中的一种二烯丙基三硫化物,具有降压降脂、杀菌消炎等多种生物学活性[12-13],近年来大蒜素抗肿瘤活性逐渐得到关注,既往贾丽[5]研究发现,大蒜素具有提高人子宫内膜癌细胞顺铂化疗敏感性的作用。本研究发现,较单用大蒜素或顺铂,大蒜素与顺铂联合用药能够显著提高人宫颈癌He La细胞增殖抑制率和细胞凋亡率,CI为0.69,提示大蒜素与顺铂对人宫颈癌He La细胞增殖具有协同抑制作用。
      
      抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡是顺铂抗肿瘤的主要作用机制[14-15]。细胞周期正常运转是维持细胞分裂增殖的重要机制,由多种基因蛋白参与调控。徐楗荧等[16]研究发现抑制细胞周期G1期-S期转换可做为抗肿瘤药物的靶点,Cyclin D1和CDK2主要在G1期表达,具有驱动G1期-S期转换的作用[17];P27能够与Cyclin D1形成复合体而抑制其生物活性,阻滞G1期-S期转换进而抑制细胞增殖[18]。因此,Cyclin D1、CDK2表达上调和P27表达下调是加速细胞周期进程、导致细胞增殖失控而引发癌变的重要因素。线粒体凋亡途径是顺铂诱导肿瘤细胞凋亡的重要通路,Bax能够提高线粒体膜通透性、促进细胞色素C释放并剪切活化Caspase-3,Cleaved Caspase-3能够剪切细胞核蛋白、结构蛋白而诱导细胞凋亡[19];Bcl-2则能够与Bax形成异源二聚体而抑制Bax活性,因此Bax/Bcl-2比值则能够反映Bcl-2蛋白家族对细胞凋亡的调控作用[20]。本研究发现,较单用大蒜素或顺铂,大蒜素与顺铂联合用药能够明显下调Cyclin D1、CDK2、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达并明显上调Bcl-2、P27蛋白表达,显著提高Bax/Bcl-2比值,这可能是大蒜素与顺铂协同抑制人宫颈癌He La细胞增殖的重要分子机制。
      
      大蒜素与顺铂对人宫颈癌He La细胞增殖具有协同抑制作用;作用机制可能与调节细胞周期和凋亡相关蛋白表达,进而阻滞细胞周期进程、促进细胞凋亡有关。
      
      利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
      
      参考文献
      
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